2.5 Protamex酶水解对玉米谷蛋白表面疏水性的影响

蛋白质表面疏水性是维持其空间结构、界面性质及分子间相互作用力的重要因素。由表1可知，Protamex酶水解物的表面疏水性显著升高（P＜0.05），随着水解时间的延长，表面疏水性指数持续增加。在蛋白质天然构像中，一部分疏水性氨基酸会埋藏在蛋白质分子内部，而经过水解后谷蛋白分子结构变得松散、舒展，使原本包埋于分子内部的疏水基团暴露于表面，疏水基团暴露的增多使得疏水性增强，分子柔性增大，这有利于蛋白质在界面上吸附速率的升高从而提高起泡性。与内源荧光光谱的结果一致，150 min水解物的表面疏水性显著高于其他样品，但其起泡力和泡沫稳定性均降低，这可能是由于此时谷蛋白分子的其他性质因素变化对其泡沫性质的消极作用更显著。

2.6 Protamex酶水解对玉米谷蛋白拉曼光谱的影响分析

由图5可知，玉米谷蛋白及其Protamex酶水解物的拉曼光谱在酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）和酰胺III带（1 230～1 350 cm-1）均有属于肽键（—CO—NH—）的振动模式，酰胺I带振动模式主要源于肽基平面内C＝O伸缩振动和较小程度的N—H弯曲振动，并且水解物的在1 650 cm-1附近和1 290 cm-1附近的谱峰的强度与玉米谷蛋白相比有所减弱，反映了水解后蛋白质的二级结构发生改变。波数1 004 cm-1归属于苯丙氨酸苯环伸缩振动，由于该谱峰受外界环境影响小而被作为归一化因子。850 cm-1和830 cm-1附近的谱带为酪氨酸双峰带，760 cm-1附近的谱带为色氨酸吲哚环的振动，其谱峰强弱反映了其所处微环境的变化情况。

图5不同水解时间玉米谷蛋白的拉曼光谱

2.6.1 Protamex酶水解对玉米谷蛋白主链构象分析

通常利用酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）对各蛋白质二级结构进行定量分析。酰胺I带拉曼光谱峰的蛋白质二级结构主要由α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、无规卷曲（1 661～1 665 cm-1）、β-折叠（1 666～1 680 cm-1）及β-转角（1 681～1 690 cm-1）附近等构成。由图6可知，玉米谷蛋白中α-螺旋结构含量最高（39.56%），β-折叠和β-转角结构含量相似（21%左右），无规卷曲含量最低（17.99%）。Protamex酶水解物中α-螺旋结构含量显著降低，在酶解120 min时达到最低（26.07%）。随着水解时间的延长，β-折叠结构含量无明显变化，无规卷曲结构含量逐渐增加，β-转角含量显著增加（除150 min酶解物）。这说明Protamex酶水解使玉米谷蛋白的有序结构向无序结构转变，分子柔性增加。Yong Yehui等在PG酶处理麦谷蛋白后发现其的二级结构更加灵活，同时也伴随着β-转角含量增加的现象。α-螺旋结构含有较多氢键，而玉米谷蛋白水解物中蛋白质/多肽表面所带同种电荷增多也会导致氢键断裂使得α-螺旋结构减少。本研究中玉米谷蛋白质分子无序结构增加，分子柔性增强，利于分子内部的疏水性氨基酸暴露，提高蛋白质的疏水性，从而达到改变起泡性和泡沫稳定性的目的。但水解时间延长至150 min无规卷曲结构含量显著高于β-折叠结构，此时玉米谷蛋白水解物的起泡性和泡沫稳定性均有降低，这可能说明高比例的无规卷曲结构不利于玉米谷蛋白在界面形成稳定的界面膜。

图6水解时间对玉米谷蛋白二级结构含量的影响

2.6.2 Protamex酶水解对玉米谷蛋白侧链构象分析

酪氨酸双峰带位于850 cm-1和830 cm-1附近的谱带，是酚羟基的氢键的良好指标。通常用酪氨酸双峰的羟苯基环的呼吸振动和环平面外弯曲振动倍频之间费米共振谱线的相对强度比（I850/I830）反映氢键状态和酪氨酸侧链中酚羟基的电离状态，判定蛋白质中酪氨酸残基的暴露或者埋藏情况。当I850/I830＞1.0时，表明酪氨酸残基暴露于水相环境，能够参与温和的或者微弱的氢键作用，而I850/I830＜1.0时，表明酪氨酸残基埋藏在疏水环境，倾向于充当氢键供体，起到增强氢键的作用。如图7所示，本研究中玉米谷蛋白的I850/I830为0.58，表明酪氨酸残基埋藏于分子内部。当Protamex酶水解60 min以后，I850/I830均＞1.0，此时酶解物中酪氨酸残基呈“暴露”态。这与本研究中疏水相互作用的结果相符（表1）。

图7水解时间对玉米谷蛋白I850/I830和I760的影响

色氨酸残基的吲哚环伸缩振动会在760 cm-1附近产生光谱，代表色氨酸芳香基的局部环境的变化，埋藏残基比暴露在极性环境中的残基表现出更强的760 cm-1带强度。由图7可知，随水解时间延长，水解物的I760强度逐渐降低。这说明酶解使色氨酸残基逐渐趋向于“暴露”态，疏水相互作用增强提高了蛋白质的表面疏水性，这与内源荧光光谱和表面疏水性的结果一致。江连洲等利用Protex6L酶制剂水解大豆蛋白得到了相似结论，水解可使大豆蛋白分子表面色氨酸、酪氨酸残基等暴露增多。

2.7 Protamex酶水解对玉米谷蛋白静态流变学性质的影响

蛋白溶液的流变学特性是评价蛋白质气/水界面性质的重要指标。由图8可知，玉米谷蛋白及其水解物分散液的表观黏度随着扫描频率的增加而逐渐减小，表现为剪切稀释的流变特性，所有样品均为非牛顿假塑性流体。这说明水解作用没有改变谷蛋白分散液的流变行为。同时，样品分散液的表观黏度与剪切速率能够较好地拟合牛顿幂律方程，即R2＞0.95（表2）。

表2不同水解时间的玉米谷蛋白水解物流变学拟合参数

图8水解时间对玉米谷蛋白的表观黏度的影响

根据牛顿幂律方程，K值为黏度系数，代表了流体的黏稠程度，K值越大代表流体越黏稠。由表2可知，K值的变化趋势与图8表观黏度一致，呈现出先增加后降低的趋势，水解120 min样品的K值达到最大，比玉米谷蛋白增加了67%。这一方面是由于酶水解使玉米谷蛋白的粒径减小、溶解性显著提高。另一方面，与天然玉米谷蛋白相比，水解物中的蛋白质/多肽的结构趋于无序、分子柔性更大、表面净电荷降低。这都有了利于增强蛋白质的水合能力，使得复水后蛋白质-蛋白质之间的相互作用增强，表现为表观黏度增强。因此，Protamex酶对玉米谷蛋白的适当水解提高了其水解物中可溶性蛋白质分子定向吸附能力，是其起泡性改善的关键因素。但水解150 min，酶解物的表观黏度下降，这是由于过度水解导致水解物中蛋白质/多肽的粒径持续降低、无序结构增加、静电斥力增大等导致蛋白质溶液流动性增强，分子间相互作用减弱。N为流动指数，代表液体的流动性能，表2中水解150 min样品的n显著高于其他样品，这也表明了此时分散液的流动性最大。

3结论

采用Protamex酶水解玉米谷蛋白，通过控制水解时间能够显著提高玉米谷蛋白的泡沫性质。当水解时间120 min，水解物的起泡性和泡沫稳定性最高，分别为（350.57±2.83）%和（228.39±2.90）%，且气泡细小均匀、蛋白膜较厚。此时水解物的溶解性较佳、表观黏度值最高。适当的水解一方面使玉米谷蛋白溶解性提高、表面张力降低、分子尺寸减小；另一方面使谷蛋白的α-螺旋含量降低、无规卷曲与β-转角含量增加、疏水性氨基酸残基暴露，进而使分子柔性增强、表面净电荷减少、表面疏水性增强。这有利于玉米谷蛋白水解物中蛋白质分子/多肽持续吸附在界面之上，在气泡之间可形成有一定黏弹性的保护层，促进泡沫的形成以及维持泡沫体系的稳定。然而持续水解至150 min导致水解物中蛋白质/多肽分子尺寸持续降低、结构过度变形即无规卷曲含量显著高于β-转角含量及表面净电荷增加，这导致水解物的气泡间的蛋白膜出现流体排水现象，使得界面膜破裂，气泡将逐渐靠近聚合，即起泡性和稳定性下降。本研究对蛋白酶水解改善玉米谷蛋白和其他植物蛋白起泡性等功能性质的应用和研究提供了一定的理论依据，为玉米蛋白的高值化利用提供参考。