1膜的性质及实验方法

1.1膜的表面张力与微观结构

实验采用的生物膜—肺表面活性剂膜萃取自固尔苏Curosurf猪肺磷脂注射液（80 mg/mL）。固尔苏主要成分为二棕榈酸磷脂酰胆碱（Dipalmitoyl-phosphatidylcholine,DPPC），摩尔分数为25%，质量分数为47%，其余为多不饱和脂肪酸磷脂PUFA–PL（26 mol%）、缩醛磷脂（3.8 mol%）和极少量的胆固醇（0.08 mol%）和蛋白质。实验采用氯仿‒甲醇法对固尔苏进行萃取，制备好的样品为1 mg/mL的固尔苏–氯仿溶液，同时掺混了荧光剂Texas Red（1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt,TR-DHPE），与固尔苏中DPPC的混合摩尔比为99.8∶0.2。

采用课题组自主研发的约束液滴表面测量仪（Constrained Drop Surfactometry,CDS）测量膜在不同密度下的表面张力，如图1所示，图中x与z分别代表水平与竖直方向，s代表液滴表面切向方向，ψ为液滴表面与水平方向内夹角，R0为液滴半径，ρ为液滴密度，g为重力加速度。CDS上的圆形基座用于盛放纯水液滴（约10µL），以微量进样针将稀释的固尔苏–氯仿溶液滴定到液滴表面，形成形状类似于肺泡的水‒气界面固尔苏肺表面活性剂膜。基座中央的小孔通过导管与注射器相连，注/抽水速度由Labview编程的推进器控制，以此调节液滴表面积的变化速率。实验测量的是膜在压缩过程中表面张力与膜密度变化的关系，液滴表面积以0.05的准静态速率缩小。液滴的轮廓由照相机拍摄。膜表面张力和表面积以ADSA（Axisymmetric Drop Shape Analysis）方法分析得出。膜表面压强，其中，纯水表面张力。

图1约束液滴表面测量仪

图2为膜表面压强随膜密度的变化曲线，（以DPPC磷脂分子所占平均面积作为衡量膜密度的物理量）。在显微镜下观察了膜在不同密度下的形貌（图2中4张照片）。膜被压缩到100Å2/molecule之前，处于液态扩张（Liquid Expanded,LE）相，磷脂分子排列较松散，膜表面结构均匀。当膜被压缩到60～100Å2/molecule时，膜上开始出现直径为几微米的磷脂凝聚（Tilted Condensed,TC）相（照片中斑点），TC区域内磷脂分子的排列比LE区域更紧密。荧光剂Texas red DHPE倾向于分布在LE区域，因此LE区域显示为浅色，TC区域显示为深色。膜继续被压缩，在LE‒TC共存相阶段，膜表面压强恒定在45 mM/m左右，TC区域数量和面积占比增大。当膜被进一步压缩（<60Å2/molecule），此时膜表面几乎被TC区域占据，TC区域相互挤压，导致膜表面压强直线上升，LE区域仅存在于TC区域之间的空隙。

图2肺表面活性剂膜表面压强随膜密度的变化

1.2颗粒在膜上的扩散实验系统制备

在培养皿中制备颗粒在水‒气界面肺表面活性剂膜上的扩散系统时，为防止颗粒沉淀，水相液体选用密度为1.15 g/mL的蔗糖‒氯化钠溶液，蔗糖质量分数为45%，氯化钠质量浓度为9 g/L。选取内径89 mm的玻璃培养皿作为承载膜的容器。先在培养皿内倒入厚约1 mm的蔗糖‒氯化钠溶液，之后用微量进样针将固尔苏‒氯仿溶液滴定到蔗糖‒氯化钠溶液表面。本文实验在界面上滴定了68、102、146和204Å2/molecule共4个密度的膜，对应图2中的4张照片。经过3次重复实验，膜的形貌未发生明显改变。

实验采用的亚微米颗粒为羧酸盐修饰的聚苯乙烯荧光微球，直径分别为0.2、0.5和1.0µm。将该荧光微球稀释至一定浓度后装入喷雾器，喷雾器从高处缓缓将颗粒喷洒至膜表面。为防止表面对流干扰颗粒布朗运动的观测，使用特氟龙圆环（外径12 mm，内径6 mm，高2.5 mm）隔绝出一部分区域的膜，再盖上盖玻片，静置10 h后，可基本消除表面对流。

1.3颗粒布朗扩散的测量

实验采用Olympus显微镜（配备60倍物镜）观察颗粒在膜上的布朗运动，同时利用电子增益高速摄像机（Andor 897 EMCCD）进行拍摄。每个视频拍摄时间为200 s，帧频为0.05 s，曝光时间5 ms，图像尺寸为300像素×300像素，分辨率为0.26µm/m。采集原始图像中的颗粒灰度值不符合标准高斯分布，因此使用图像处理软件ImageJ对图像进行背景去噪声（Background Subtraction）和高斯模糊（Gauss-ian Blur）处理（图3（a）），使颗粒灰度值达到标准高斯分布（图3（b））。之后用Video Spot Tracker软件定位每个颗粒的灰度峰值（图3（c）），即颗粒质心，定位误差仅为0.5像素，进而对颗粒二维运动轨迹（平面）进行实时跟踪。软件自动将颗粒在每一时刻的像素位置坐标存入计算机中，使用MATLAB计算颗粒在不同时间间隔Δt内沿和方向的位移，计算公式如下：

图3图像处理与颗粒轨迹追踪示意图